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1. 배지 만들기 & 균 접종
1. 배지 만들기 & 균 접종
1. Purpose
배지에는 미생물이 필요로 하는 영양소가 모두 있어야 한다. 그 조성은 미생물의 종류나 실험 목적에 따라 다르므로 그 미생물에 맞는 배지를 사용할 필요가 있다. 또 미생물의 배양에는 수소이온 농도가 중요하므로 미생물에 적당한 pH를 조절하여야 한다.
표준 한천 배지는 주로 물이나 식품 중의 세균 수를 측정할 때 사용된다. 또한 식품 위생법에 의한 우유, 유제품, 냉동식품 등의 규격 검사에 사용된다. LB broth는 박테리아 성장에 주로 사용된다.
평판도말법에 의한 균의 순수 분리 법 및 이식 방법은 시험관 내의 보존 균주를 새로운 배지에 옮기거나, petri dish에 나타난 colony로부터 균을 분리하려는 조작으로 잡균의 침입을 방지하기 위해 무균 상자 내에서 실시한다. 배양액 중에는 미생물 이외의 잡균이 혼재되어 있으므로 평판 도말을 반복하여 목적하는 미생물을 순수 분리한다.
2. Materials and Equipment
2.1. 표준 한천 배지 (Plate Count Agar, PCA)
물이나 식품 중의 세균 수를 측정할 때 사용함.
식품 위생법에 의한 우유, 유제품, 냉동 식품 등의 규격 검사에 사용함.
표 1. 표준 한천 배지 조성
1L 250mL Tryptone 5.0g 1.25g Yeast Extract 2.5g 0.625g Dextrose 1.0g 0.25g Agar 15.0g 3.75g 3 차 증류수 Up to 1L Up to 250mL
pH 7.0 ± 0.2 , Autoclave
10N NaOH 용액, 플라스크, Thermo Fisher pH meter, 250mL 매스 실린더
2.2. LB배지 (LB broth)
박테리아 성장에 주로 사용 됨.
표 2. LB broth조성
1L 300mL LB broth 25.0g 7.5g 3 차 증류수 Up to 1L Up to 300mL
pppH X, Autoclave
500mL 매스 실린더, 500mL 유리 보틀
2.3. 평판 배지, 사면 배지
Petri dish, 14mL tube, 백금이, 알코올 램프
3. Methods
3.1. 배지 만들기
3.1.1표준 한천 배지 (Plate Count Agar, PCA)
플라스크에 3차 증류수 180mL를 받는다. 플라스크에 Stirrer bar를 넣고 magnetic stirrer에 올려주어 잘 섞이게 한다. Tryptone을 1.25g, Yeast Extract를0.625g, Dextrose를0.25g을 플라스크에 넣어준다.
Thermo Fisher pH meter를 이용해 pH를 측정한다. 이때, pH측정 전 증류수로 pH meter를 깨끗이 씻어주어 오염을 방지한다. 깨지지 않도록 주의한다. 10N의NaOH로 pH 7.0 ± 0.2로 조정한다.
만든 용액을 매스 실린더에 옮긴다. 3차 증류수를 이용해 총 용량을 250mL로 맞춘다.
삼각 플라스크에 agar 3.75g를 넣고 autoclave에서 녹인다. Agar를 넣은 삼각 플라스크에 만들어 둔 용액을 넣는다. 호일로 입구를 막는다. 멸균 테이프를 붙인다. “표준 한천 배지” 라고 labeling 한다(Picture 1).
Autoclave의 뚜껑을 열고 증류수의 수위를 확인한 후, 필요한 만큼 채워준다. 만든 배지를 autoclave에 넣는다. 뚜껑을 꼭 닫아주고 autoclave를 작동시킨다. 작동이 완료된 autoclave의 온도를 확인 후 뜨거운 배지를 조심히 꺼낸다.
3.1.2. LB배지 (Luria-Bertani broth)
Stirrer bar를 이용해 LB broth 7.5g을 3차 증류수 200mL 에 녹여준다. 재료를 충분히 녹인 후3차 증류수를 추가하여 총량을 맞춘다. 재료를 충분히 녹인 후500mL 매스 실린더에 배지를 부어준다. 3차 증류수로 총량을 300mL로 맞춘다.
300mL의LB broth를 500mL 유리 보틀에 넣는다. 용기에 가득 담을 시autoclave중 끓어 넘칠 수 있으므로 부피가 여유로운 용기를 사용한다. 뚜껑을 느슨하게 닫는다. 뚜껑을 은박지로 감싼 후 멸균 테이프를 붙인다. “LB broth” 라고 labelling 한다(Picture 2).
Autoclave의 뚜껑을 열고 증류수의 수위를 확인한 후, 필요한 만큼 채워준다. 만든 배지를 autoclave에 넣는다. 뚜껑을 꼭 닫아주고 autoclave를 작동시킨다. 작동이 완료된 autoclave의 온도를 확인 후 뜨거운 배지를 조심히 꺼낸다.
Picture 1 . 완성된 표준 한천 배지
Picture 2 . 완성된 LB broth
3.2. Pour Media
Clean bench사용 전, 알코올을 뿌리고 닦아낸다. 알코올 램프를 켜 오염을 방지한다.
3.2.1. 평판 배지 붓기
충분히 식힌 표준 한천 배지와 petri dish를 준비한다. Petri dish에 배지를3/4정도 붓고 뚜껑을 닫아 고루 퍼지게 한다(Picture 3).
10회 반복한다. 탑 형식으로 쌓아 clean bench에서 말려준다(Picture 4).
Picture 3 . 평판 배지 Picture 4 . 탑 형식으로 쌓은 평판 배지
3.2.2. 사면 배지 붓기
14mL tube에 “PCA”라고 labelling한다. PCA agar배지 입구를 화염 멸균한다. Pipette aid에tip을 연결하고PCA agar 3~5mL를 14mL tube에 넣는다. Tube의 뚜껑을 닫아 눕혀서 굳힌다. 10회 반복한다(Picture 5).
Tip을 분리하고 알코올 램프를 끄고 마무리한다.
Picture 5 . 사면 배지와 PCA agar
3.3. 균 접종
3.3.1. 평판 배지의 접종
평판 배지의 바닥 면에 이름, 접종 날짜, 접종한 균을 기입한다(Picture 6). 뚜껑에 기입할 시 다른 배지와 혼동이 될 수 있으므로 바닥면에 기입한다.
Picture 6 . 평판 배지 바닥 면
백금이를 화염 멸균한다. 백금이의 손잡이부터 백금이까지 천천히 화염에 통괴시키면서 붉게 변색 될때까지 멸균시키고 램프 근처에서 식힌다. 균 접종 전 후로 세균 침투 및 오염 방지를 위해서 필수 과정이다. 미리 획선 도말해 놓은 접종하려는 균의 single colony를 백금이로 취한다(Picture 7).
Picture 7 . Single colony 획득
Single colony를 획선 도말 (Streaking) 한다. 얻기 위해 Figure1의 1, 2, 3단계 후 화염 멸균한다(Figure 1). 화염멸균 후Figure 1의 빨간 부분에 백금이 끝부분을 갖다 대서 식힌다.
Figure 1 . 평판 배지 streaking 순서
3.3.2. 사면 배지의 접종
사면 배지의 tube에 이름, 접종 날짜, 접종한 균을 기입한다(Picture 8).
Picture 8 . 사면 배지의 tube
사면 배지를 뚜껑을 닫은 채로 화염 멸균한다. 뚜껑을 열어 입구와 뚜껑 부분 다시 화염 멸균한다. 백금이를 화염 멸균 하고 식힌다. 사면 배지의 응축수를 백금이의 끝으로 소량만 따낸다. 접종하고자 하는 균의 single colony를 백금이로 취한다. 사면 배지의 안쪽부터 바깥 쪽으로 도말한다(Figure 2).
Figure 2 . 사면 배지 streaking
사면 배지의 입구를 화염 멸균하고 뚜껑을 닫는다.
3.3.3. Incubation
접종한 사면 배지, 평판 배지를 37℃ incubator에서 overnight배양한다(Picture 9).
Picture 9 . Overnight culture
4. Results and Discussion
평판 배지, 사면 배지 모두 Escherichia coli가 자랐음을 확인할 수 있다(Picture 10, 11).
Picture 10 . 평판 배지 결과
Picture 11 . 사면 배지 결과
5. References
노완섭, ⎡ New식품 미생물학 실험편⎦, 지구문화사(2013)
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